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毕赤酵母分泌表达植物病毒蛋白制备自组装纳米催化剂及其催化性能研究

作者:完美论文网  来源:www.wmlunwen.com  发布时间:2021/3/5 15:33:23  

摘要:病毒样颗粒(VLPs)包裹纳米粒子的亚细胞结构仿生设计在催化领域潜力巨大。论文首先构建了一株基于毕赤酵母(Pichia pastoris)的基因工程菌,用于分泌表达重组豇豆褪绿斑驳病毒衣壳蛋白(CCMV CPs),优化表达条件和纯化蛋白后,收获了较高产量和较高纯度的衣壳蛋白;接着利用稳定剂稳定钌(Ru)纳米颗粒(NPs),通过静电引力作用使纯化后的CCMV CPs能够封装Ru NPs,制备具有核壳结构的复合纳米催化剂Ru@VLPs;然后以硝基芳烃化合物4-硝基苯酚(4-NP)催化还原为模型反应进行催化剂性能的评价;最后通过回收循环实验探究其可重复利用性。结果如下:

成功构建并筛选出高拷贝基因工程菌株CN15683-3,以毕赤酵母为表达系统,通过单因素和正交试验优化了蛋白诱导表达条件,当诱导温度为30 oC、诱导时间为96 h、每24 h添加终浓度1.0 %的甲醇时,发酵上清液中的CCMV CPs收率最高可达101.4 ± 3.2 mg/L,通过镍柱纯化和阴离子交换柱纯化,纯度也超90 %。CCMV CPs经分解缓冲液和重组缓冲液透析后,具有较强的体外自组装性能,经TEM检测,CCMV VLPs分散性好,粒径大小为27.7 ± 0.6 nm。

对比四种稳定剂柠檬酸钠(CA),聚乙烯醇(PVA),单宁酸(TA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修饰Ru NPs,利用胶体法得出CA稳定的Ru-CA稳定性分散性好于另外三种,而且电负性更大,更易被封装,封装后的平均粒径为22.8 ± 0.6 nm,封装率可以达到70 %左右,成功制备限域催化剂Ru@VLPs。

在4-NP催化还原反应中,以未被封装的Ru-CA催化剂作为对照组,以限域催化剂Ru@VLPs作为实验组。结果表明,Ru@VLPs在反应中显示出更高的催化活性,其对4-NP的转化率可达到95 %高于Ru-CA组的85 %,其表观反应速率常数(k)达到约0.14 min-1高于Ru-CA组的0.08 min-1,经计算,它催化的4-NP还原反应活化能为32 kJ/mol,略低于Ru-CA组的39 kJ/mol。

催化剂的回收循环实验结果说明Ru@VLPs具有较好的回收再利用性能。经4次循环使用后,对4-NP的转化率从约82 %降至约69 %。

关键词:病毒样颗粒;毕赤酵母;分泌表达;限域纳米催化剂;4-硝基苯酚还原反应

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